Гуминовые кислоты, полученные из леонардита, для улучшения ферментативной активности и биодоступности питательных веществ в карбонатной почве

1. Введение

Давно сообщалось о влиянии органического вещества почвы на рост растений и поглощение питательных элементов [1–4]. Гуминовые кислоты наряду с фульвокислотами являются важными компонентами органического вещества почвы и играют ключевую роль в улучшении свойств почвы [5–7].

Несмотря на то, что гуминовые кислоты, извлечённые из почв с различными почвенными условиями (песчаные, суглинистые или глинистые почвы) и из разных географических регионов, имеют сходные аналитические характеристики и химическую структуру, фракции с высокой молекулярной массой демонстрируют более выраженное влияние на ферментативную активность почвы по сравнению с фракциями с низкой молекулярной массой [8–12].

Это указывает на то, что размер молекулярной массы является важным фактором, определяющим степень влияния на ферментативную активность почвы.

Служебная информация статьи

Дата поступления: 08.01.2020

Дата принятия: 12.03.2020

Биографии авторов

• Цянь Сунь — аспирант, область исследований: использование удобрений в почвенной среде
• Юньцун Ли — профессор
• Сюэ Ли — PhD
• Лиру Ся — профессор
• Чжункай Чжоу — PhD
• Мэйна Чжан — PhD
• Бин Ли — PhD

(у всех одна область: использование удобрений в почвенной среде)

Контактные авторы

• Цзяньлун Лю
• Ляньфэй Хо

Большое количество гуминовых веществ является основными компонентами продуктов окисления органического вещества и формируется с различной молекулярной массой на поверхности углей в зависимости от условий окисления в природной среде.

При промышленном производстве для сельского хозяйства гуминовые кислоты получают путём активации углерода в таких материалах, как леонардит [13–17].

Однако проведено относительно мало исследований, показывающих, как гуминовые кислоты, извлечённые из леонардита, влияют на почвенные ферменты и биодоступность питательных веществ [18].

В связи с этим целями данного исследования являлись:

• определение оптимальной молекулярной массы гуминовых кислот;
• определение оптимальных доз внесения в искусственные садовые почвы;
• изучение их влияния на ферментативную активность почвы и содержание питательных веществ.

Полученные результаты позволят получить ценную информацию для применения леонардита с целью улучшения почв.

2. Материалы и методы

2.1 Подготовка гуминовых кислот

Гуминовые кислоты были извлечены из леонардита с использованием метода, предложенного Международным обществом гуминовых веществ (IHSS) [19].

Кратко:

• Водный раствор гидроксида калия (KOH) концентрацией 0,1 моль/л смешивали с леонардитом и оставляли на 24 часа.
• Затем смесь центрифугировали при температуре 25°C, после чего надосадочную жидкость (супернатант) отделяли с помощью пипетки.
• Значение pH надосадочной жидкости доводили до 7,0 путём добавления раствора серной кислоты (H₂SO₄) концентрацией 0,1 моль/л.
• Полученный раствор переносили в цилиндр из оргстекла (высота 70 см, диаметр 10 см) и оставляли отстаиваться на 24 часа.
• После этого верхнюю, среднюю и нижнюю части раствора, соответствующие низкой, средней и высокой молекулярной массе, последовательно отбирали из колонны [20].

Согласно закону Стокса, скорость оседания пропорциональна размеру молекул, поэтому:

• верхняя часть была обозначена как HS1 (низкая молекулярная масса);
• средняя — HS2 (средняя молекулярная масса);
• нижняя — HS3 (высокая молекулярная масса).

Также в исследование были включены:

• смесь всех фракций (HS);
• исходный леонардит (IM).

Сульфат калия (K₂SO₄) добавляли к воздушно-сухим образцам HSmix, HS1, HS2, HS3, SED и IM для выравнивания содержания калия до одинакового уровня.

2.2 Обработка почвы и инкубация

Эксперимент был выполнен по полностью рандомизированной схеме с шестью нормами внесения (0, 200 мг/кг, 400 мг/кг, 600 мг/кг, 800 мг/кг и 1000 мг/кг) шести фракций гуминовых кислот (HSmix, HS1, HS2, HS3, SED, IM) с четырьмя повторностями.

Почва (Krome очень щебнистый суглинок (Loamy-skeletal, carbonatic, hypothermic Lithic Udorthents)) была отобрана с глубины 0–15 см на опытном поле Центра тропических исследований и образования (TREC), Университет Флориды, г. Хоумстед, штат Флорида.

Почва была высушена на воздухе, затем просеяна через сито (<2 мм).

Основные свойства почвы

• pH — 7,3
• органический углерод — 18,7 г/кг
• калий (Mehlich-3) — 93,12 мг/кг
• фосфор — 97,69 мг/кг
• кальций — 20,45 мг/кг
• магний — 160,99 мг/кг

Каждая фракция гуминовых кислот смешивалась с почвой (по 300 г) и помещалась в пластиковые бутылки объёмом 500 мл.

В каждую ёмкость добавлялась деионизированная вода до уровня полевой влагоёмкости.

Контейнеры инкубировали при комнатной температуре (25°C) в течение 70 дней.

Дополнительно вода вносилась еженедельно на основе изменения массы образцов для компенсации потерь от испарения.

2.3 Анализ почвы

Из каждой бутылки отбирали два образца почвы на 40-й и 70-й день.

• Один образец сохранялся во влажном состоянии и хранился при 4°C для определения ферментативной активности
• Второй образец высушивался на воздухе при комнатной температуре для химического анализа

Для оценки ферментативной активности определяли три фермента:

• фосфомоноэстеразы (кислая и щелочная фосфатазы)
• фосфодиэстераза
• уреаза

Активность уреазы определяли по модифицированному методу Gouglas и Bremner [21] и Zantua и Bremner [22].

Активность фосфомоноэстераз и фосфодиэстеразы определяли фотометрическими методами [23–25].

Для химического анализа почвы использовали экстракцию методом Mehlich-3 (M-3), включающим раствор:

• 0,2 M CH₃COOH
• 0,25 M NH₄NO₃
• 0,015 M NH₄F
• 0,013 M HNO₃
• 0,001 M EDTA

Фосфор в экстрактах определяли методом аскорбиновой кислоты с использованием спектрофотометра (DU 640, Beckman Instruments Inc., США).

Концентрации K, Ca, Cu и Zn определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра (AA-6300 Shimadzu, США).

2.4 Статистический анализ

Данные подвергались статистической обработке с использованием программного обеспечения SAS (версия 8.0), с применением критерия Дункана для разделения средних значений (p ≤ 0,05) [26].

3 Результаты и обсуждение

3.1 Ферментативная активность почвы на 40-й день после внесения гуминовых веществ

Гуминовые кислоты играют важную роль в функционировании ферментов, поскольку составляют значительную часть органического вещества почвы и могут способствовать стабилизации или ингибированию ферментативной активности [27].

Через 40 дней активность уреазы в контрольном варианте составила 69,49 мг/(кг·ч), что было выше, чем в варианте HS3 (50,47 мг/(кг·ч)).

Варианты HS1 и HS2 снижали ферментативную активность по сравнению с контролем.

Активность фосфодиэстеразы была наибольшей при применении HS1 при норме внесения 600 кг/га.

Максимальные значения фосфодиэстеразы для вариантов HS1, HS2 и HS3 составили:

• 51,0 мг/(кг·ч)
• 43,0 мг/(кг·ч)
• 48,0 мг/(кг·ч)

соответственно, что было выше, чем в контроле (35,04 мг/(кг·ч)).

Все варианты HS увеличивали активность кислой фосфатазы при низких дозах внесения (200 и 400 кг/га), однако при более высокой дозе (600 кг/га) активность снижалась до 58,5 мг/(кг·ч) (Рисунок 1).

Аналогичная тенденция наблюдалась для HS1: активность фосфатазы достигала максимума (75,6 мг/(кг·ч)), затем снижалась при увеличении дозы.

Активность щелочной фосфатазы была выше при применении HS1 (174,6 мг/(кг·ч)) по сравнению с HS2 (158,0 мг/(кг·ч)) и HS3 (162,0 мг/(кг·ч)).

Эти результаты показывают, что молекулярная масса гуминовых веществ существенно влияет на активность кислой и щелочной фосфатазы, особенно при низкой молекулярной массе (HS1).

Однако при высокой дозе внесения (800 кг/га) активность фосфатазы снижалась до 32,10 мг/(кг·ч).

В целом гуминовые вещества подавляли активность уреазы, причём наиболее сильное влияние наблюдалось у фракций с высокой молекулярной массой (HS3).

Варианты SED и IM также стимулировали активность фосфодиэстеразы и кислой и щелочной фосфомоноэстеразы на уровнях, значительно превышающих контроль через 40 дней.

3.2 Ферментативная активность почвы на 70-й день после внесения гуминовых веществ

Реакция почвенных ферментов на большинство гуминовых веществ через 70 дней была значительно выше, чем через 40 дней.

Активность уреазы в контроле составила 102,8 мг/(кг·ч), что было значительно выше, чем во всех других вариантах, при этом наименьшая активность уреазы наблюдалась в варианте SED (38,07 мг/(кг·ч)).

По сравнению с контролем, активность фосфодиэстеразы значительно увеличивалась при применении HS2 и HS3.

Максимальное значение фосфодиэстеразы составило 66,2 мг/(кг·ч) в почвах, обработанных HS3.

Активность ферментов почвы изменялась с увеличением доз внесения гуминовых веществ (Рисунки 1 и 2).

Активность уреазы в варианте HS3 (9,5 мг/(кг·ч)) достигала минимального значения при дозе 600 кг/га, затем увеличивалась до 27,42 мг/(кг·ч).

Варианты SED и IM также подавляли активность уреазы.

Стимулирующий эффект увеличивался с ростом доз HS1, однако линейной зависимости между активностью кислой фосфатазы и дозами HS1 не наблюдалось.

По сравнению с контролем, активность кислой фосфатазы значительно возрастала при применении HS2, HSmix и SED.

Вариант HS3 обеспечивал наибольшую активность щелочной фосфомоноэстеразы (220,6 мг/(кг·ч)), тогда как HS1 и HS2 давали 186,01 и 169,21 мг/(кг·ч) соответственно.

Таким образом, оптимальной нормой внесения гуминовых веществ являлась 400 кг/га, а гумус с низкой молекулярной массой (HS1) был более эффективен, чем HS2 или HS3.

Результаты для фракции с наибольшей молекулярной массой (HS3) показали, что такие вещества значительно подавляют активность уреазы в почве, при этом оптимальная доза внесения составляла 600 кг/га.

Аналогично, активность кислой и щелочной фосфомоноэстеразы значительно увеличивалась при применении HS3 по сравнению с контролем через 40 дней (Таблица 1).

Рисунок 1. Активность кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы и фосфодиэстеразы в почве через 70 дней после внесения гуминовых кислот различных типов и дозировок.

Примечание: HS1 — гуминовые вещества с низкой молекулярной массой, HS2 — средней, HS3 — высокой; HSmix — смесь трёх фракций; SED — нерастворимый остаток; IM — сырой леонардит; контроль — без внесения.

Погрешности на графиках показывают стандартную ошибку среднего (±SEM).

Рисунок 2. Активность уреазы в почве через 40 и 70 дней после внесения гуминовых кислот различных типов и дозировок.

Примечание: HS1 — гуминовые вещества с низкой молекулярной массой, HS2 — средней, HS3 — высокой; HSmix — смесь трёх фракций; SED — нерастворимый остаток; IM — сырой леонардит; контроль — без внесения.

Погрешности на графиках показывают стандартную ошибку среднего (±SEM).

3.3 Влияние гуминовых веществ на содержание питательных элементов в почве на 70-й день

Концентрации фосфора (P) и меди (Cu) в почве имели тенденцию к увеличению, тогда как содержание аммонийного азота (NH₄⁺-N) снижалось при внесении гуминовых веществ, особенно с низкой молекулярной массой (HS1) (рис. 3 и 4).

Значения для HS1 (варианты a, c и d) составили соответственно:

• 12.08 мг/кг
• 10.83 мг/кг
• 13.71 мг/кг

Во всех вариантах с гуминовыми веществами содержание NH₄⁺-N было ниже, чем в контроле.

Полученные результаты указывают на роль фермента уреазы, который катализирует гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислого газа. Применение гуминовых веществ снижало активность уреазы в почве, что, в свою очередь, уменьшало скорость разложения мочевины, внесённой в виде удобрения.

Таким образом, гуминовые вещества действуют аналогично ингибиторам уреазы, которые используются в сельском хозяйстве для повышения эффективности азотных удобрений.

Концентрация цинка (Zn) увеличивалась более значительно при применении гумуса с высокой молекулярной массой (HS3). Максимальное значение (HS3b-Zn) составило 2.14 мг/кг, что выше по сравнению с HS1 и HS2.

Применение смеси гуминовых фракций (HSmix) приводило к значительному увеличению содержания калия (K), фосфора (P), меди (Cu) и цинка (Zn) по сравнению с вариантами SED и IM. Однако при этом содержание NH₄⁺-N при HSmix было ниже, чем при SED.

Наличие HSmix и SED в почве оказывало положительное влияние на содержание меди (Cu). При этом содержание кальция (Ca) между вариантами практически не различалось.

Фосфатазы (кислая и щелочная фосфатаза, а также фосфодиэстераза) играют важную роль в почве, обеспечивая минерализацию органического фосфора с переводом его в неорганическую форму, доступную для растений.

Эти ферменты также участвуют в гидролизе фосфорных удобрений типа пирофосфатов.

Рост концентрации доступного фосфора после внесения гуминовых веществ напрямую связан с увеличением активности фосфатаз, что свидетельствует об усилении минерализации органического фосфора.

Кроме того, процесс минерализации органического вещества сопровождается высвобождением других элементов питания и в целом повышает плодородие почвы.

3.4 Коэффициенты корреляции между ферментами почвы и доступными элементами питания

Было установлено, что:

• уреаза (U) и кислая фосфатаза (AP) оказывают значительное влияние на содержание калия (K);
• щелочная фосфатаза (ALP) и фосфодиэстераза (PD) существенно влияют на содержание фосфора (P) и цинка (Zn);
• ALP оказывает заметное влияние на азот (N);
• PD оказывает значительное влияние на содержание меди (Cu).

При этом ферменты U, AP, ALP и PD не оказали влияния на содержание магния (Mg) и кальция (Ca).

При сравнении трёх уравнений регрессии:

• A: AP → Y = 0.0231X + 80.349
• B: ALP → Y = 0.1438X + 56.703
• C: PD → Y = 0.5443X + 57.778

было установлено, что:

начальные значения концентраций составляют:

• AP → 80.349
• PD → 57.778
• ALP → 56.703

Фермент фосфодиэстераза (PD) оказывает наибольшее влияние на содержание фосфора, поскольку имеет самый высокий коэффициент (0.5443).

Для сравнения:

• влияние ALP — 0.1438
• влияние AP — 0.0231

Аналогично для других элементов:

Начальные концентрации:

• PD → Cu = 18.99
• PD → Zn = 0.4512
• ALP → Zn = 0.5053

Фосфодиэстераза (PD) оказывает наибольшее влияние на содержание цинка (коэффициент 0.0185).

Для сравнения:

• влияние ALP на Zn — 0.0044
• влияние PD на Cu — 0.1352

Также установлено:

• начальная концентрация K (через AP) — 75.863
• влияние активности AP на Cu — 1.305

Рисунок 3. Влияние активности почвенных ферментов на содержание доступного фосфора (Mehlich-3).

a — кислая фосфатаза; b — щелочная фосфатаза; c — фосфодиэстераза.

Данные получены на почвах через 70 дней после внесения гуминовых кислот различных типов и дозировок.

Вывод: наибольшее влияние на доступность фосфора оказывает фосфодиэстераза, умеренное — щелочная фосфатаза, минимальное — кислая фосфатаза.

Рисунок 4. Влияние активности почвенных ферментов на содержание доступных микроэлементов (Cu и Zn, Mehlich-3).

a — влияние фосфодиэстеразы на медь (Cu); b — влияние фосфодиэстеразы на цинк (Zn); c — влияние щелочной фосфатазы на цинк (Zn).

Данные получены через 70 дней после внесения гуминовых кислот различных типов и дозировок.

Вывод: ферментативная активность, особенно фосфодиэстераза, существенно повышает доступность микроэлементов (Cu и Zn), что напрямую влияет на питание растений.

4 Conclusions (Выводы)

Гуминовая кислота, особенно с высокой молекулярной массой (HS3), значительно снижала активность уреазы в почве. В то время как гуминовая кислота со средней молекулярной массой повышала активность кислой и щелочной фосфатазы в почве.

Концентрации NH₄⁺-N снижались с увеличением норм внесения гумуса.

Не все варианты обработки влияли на содержание Ca, однако концентрации K, P, Cu и Zn в почве значительно увеличивались при внесении гумуса с наименьшей молекулярной массой (HS1).

На основе уровня внесения установлено, что оптимальная норма применения гуминовых веществ составляет 600 кг/га.

Acknowledgements (Благодарности)

Финансирование было предоставлено Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20170614), Национальным фондом естественных наук Китая (NO. 61803187, 31901419), Фондом инноваций сельскохозяйственной науки и технологий Цзянсу (CX(18)3047).

[References] (Список литературы)

1. Chen Y, Clapp C, Magen H. Механизмы стимуляции роста растений гуминовыми веществами: роль органо-железных комплексов. Soil Sci Plant Nutr, 2004; 50: 1089–1095.
2. Hussein K, Fawy H A. Влияние различных уровней гуминовых кислот на содержание питательных веществ, рост растений и свойства почвы в условиях засоления. Soil and Water Res, 2011; 6: 21–29.
3. Haghighi M, Nikbakht A, Xia Y P, Pessarakli M. Влияние гуминовой кислоты в разбавленном питательном растворе на рост, эффективность питания и послеуборочные характеристики герберы. Commun Soil Sci Plant Anal, 2014; 45: 177–188.
4. Hernandez O L, Calderín A, Huelva R, Martínez-Balmori D, Guridi F, Aguiar N O, et al. Гуминовые вещества из вермикомпоста усиливают производство салата в городских условиях. Agron Sustain Dev, 2015; 35: 225–232.
5. Jones C A, Jacobsen J S, Mugaas A. Влияние низких доз коммерческой гуминовой кислоты на доступность фосфора, поглощение микроэлементов и урожайность яровой пшеницы. Commun Soil Sci Plant Anal, 2007; 38: 921–933.
6. Lee C-H, Shin H-S, Kang K-H. Химическая и спектроскопическая характеристика торфа и его гуминовых фракций (гумин, гуминовая и фульвокислоты). J Soil Groundw Environ, 2004; 9: 42–51.
7. Sharif M, Khattak R A, Sarir M S. Влияние различных уровней гуминовой кислоты из бурого угля на рост кукурузы. Commun Soil Sci Plant Anal, 2002; 33: 3567–3580.
8. Suh H Y, Yoo K S, Suh S G. Рост клубней и качество картофеля под влиянием внекорневого и почвенного внесения фульвокислот и гуминовых кислот. Hortic Environ Biotechnol, 2014; 55: 183–189.
9. Li H, Li Y, Li C. Характеристика гуминовых и фульвокислот, полученных из осадка сточных вод. Asian J Chem, 2013; 25:18.
10. Schnitzer M. Значение органического вещества почвы в почвообразовании, процессах переноса и формировании структуры почвы. Soil Utilization and Soil Fertility, 1992; 206: 63–81.
11. Kerc A, Bekbolet M, Saatci A M. Влияние окислительных методов обработки на распределение молекулярных размеров гуминовых кислот. Water Sci Technol, 2004; 49(4): 7–12.
12. Alireza N, Maryam K. Влияние внесения гуминовой кислоты в почву на поглощение питательных веществ, эфирные масла и химический состав тимьяна в теплице. Physiol Mol Biol Plants, 2018; 24(3): 423–431.
13. Skybová M, Turčániová Ľ, Čuvanová S, Zubrik A, Hudymáčová Ľ. Механохимическая активация гуминовых кислот в буром угле. J Alloys Compounds, 2007; 434–435: 842–845.
14. Arslan G, Edebali S, Pehlivan E. Факторы, влияющие на адсорбцию Cr(VI) гуминовыми кислотами из бурых углей. Desalination, 2010; 255: 117–123.
15. Hasan H S. Адсорбция радиоактивного кобальта на нанокомпозите, модифицированном гуминовой кислотой. J Radioanal Nucl Chem, 2019; 321: 403–404.
16. Liu X, Chen Y, Chi Y, Guo Z, Cai L. Влияние pH, ионной силы, посторонних ионов и гуминовой кислоты на сорбцию радионуклида Co-60. J Radioanal Nucl Chem, 2012; 292: 1357–1366.
17. Zhang X, Zhang P, Wu Z, Zhang L, Zeng G, Zhou C. Адсорбция метиленового синего на наночастицах Fe3O4, покрытых гуминовой кислотой. Colloids Surf A, 2013; 435: 85–90.
18. Nannipieri P, Sequi P, Fusi P. Гумус и ферментативная активность. In: Humic substances in terrestrial ecosystems. Elsevier, 1996; pp 293–328.
19. Fernández-Escobar R, Benlloch M, Barranco D, Dueñas A, Gutérrez-Gañán J A. Реакция оливковых деревьев на внекорневое внесение гуминовых веществ из леонардита. Scientia Horticulturae, 1996; 66: 191–200.
20. Zhang L, Yao X, Yue C, Guan J. Влияние температурных изменений на поведение железобетонных гидротехнических конструкций. North Water Transfers, 2013; 11(4): 196–198.
21. Bremner J M, Douglas L A. Влияние ингибиторов уреазы на гидролиз мочевины в почве. Soil Sci Soc Am J, 1973; 37: 225–226.
22. Zantua M I, Bremner J M. Сравнение методов определения активности уреазы в почве. Soil Biol Biochem, 1975; 7: 291–295.
23. Tabatabai M A, Bremner J M. Использование p-нитрофенилфосфата для определения активности фосфатазы в почве. Soil Biol Biochem, 1969; 1: 301–307.
24. Eivazi F, Tabatabai M A. Фосфатазы в почве. Soil Biol Biochem, 1977; 9: 167–172.
25. Browman M G, Tabatabai M A. Активность фосфодиэстеразы в почве. Soil Sci Soc Am J, 1978; 42: 284–290.
26. Arancon N, Edwards C, Lee S, Byrne R. Влияние гуминовых кислот из вермикомпоста на рост растений. Eur J Soil Biol, 2006; 42: S65–S69.
27. Steven D A. Минералы почвы и гуминовые кислоты изменяют стабильность ферментов. Biogeochemistry, 2006; 81: 361–373.
28. Wallace A J, Armstrong R D, Grace P R, Scheer C, Partington D L. Эффективность использования азота из мочевины в зависимости от сроков внесения и ингибиторов. Nutr Cycl Agroecosyst, 2020; 116: 41–56.
29. Ahmad F, Kelso W. Пирофосфат как источник фосфора: гидролиз в различных условиях. J Res (Science), 2001; 12: 130–139.